T: Expresión en Saccharomyces boulardii de la subunidad A del pili corregulado con la toxina (TcpA) de Vibrio cholerae O1.
O:Expresar la proteína TcpA de Vibrio cholerae en Saccharomyces boulardii como un primer paso para desarrollar una vacuna oral contra el cólera.
G: tcpA.
ER: EcoRV y XbaI.
EL: No se menciona en el texto.
V: pYES2.
CR: E.coli TOP10 y ura3 auxotrófica de S. boulardii, que se utilizó para la expresión del gen tcpA.
MTG: Transformación por electroporación.
MIC:
El cultivo de las levaduras transformadas se realizó en medios de crecimiento específicos, como el medio de yeast nitrogen base (YNB), donde se indujo la expresión del gen tcpA mediante la adición de galactosa al medio. Las levaduras mutantes de S. boulardii mostraron la capacidad de crecer en medios YNB, lo que indica que la transformación fue exitosa y que el gen tcpA estaba siendo expresado.
Para la identificación de clones, se utilizó la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para amplificar el gen tcpA. Esta técnica permitió confirmar la presencia del gen en las cepas transformadas, y se utilizó un par de primers específicos para asegurar la amplificación del fragmento deseado.
La secuenciación y el análisis de PCR confirmaron la presencia del gen tcpA con una alineación del 99.50%. A partir de esto, se purificó la proteína TcpA expresada en las levaduras, lo que permitió su análisis mediante SDS-PAGE y Western blot, validando así la correcta expresión de la proteína recombinante.
BIBLIOGRAFÍA:
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